WWW.UK.X-PDF.RU

БЕЗКОШТОВНА ЕЛЕКТРОННА БІБЛІОТЕКА - Книги, видання, автореферати

 
<< HOME
CONTACTS




Продажа зелёных и сухих саженцев столовых сортов Винограда (по Украине)
Тел.: (050)697-98-00, (067)176-69-25, (063)846-28-10
Розовые сорта
Белые сорта
Чёрные сорта
Вегетирующие зелёные саженцы

Продажа зелёных и сухих саженцев столовых сортов Винограда (по Украине)
Тел.: (050)697-98-00, (067)176-69-25, (063)846-28-10
Розовые сорта
Белые сорта
Чёрные сорта
Вегетирующие зелёные саженцы
Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |

«ЗАТВЕРДЖУЮ Ректор С.В. Іванов (Підпис) «» 2014 р. МОЛЕКУЛЯРНА БІОТЕХНОЛОГІЯ МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ до вивчення дисципліни та виконання контрольної роботи для студентів спеціальностей ...»

-- [ Страница 4 ] --

Крім того, він здатний інтеркалювати (вбудовуватися) між основами дволанцюгової ДНК. Це призводить до різкого зростання його флуоресценції при збудженні ультрафіолетовим світлом. EtBr має чотири оптимальні значення довжини хвилі для збудження флуоресценції (максимуми поглинання): 300, 336, 360 і 545 нм.

Щоб запобігти фотодеградації нуклеїнових кислот, попередню обробку гелю барвником бажано проводити у темряві і використовувати для збудження довжину хвилі 300 нм, якій відповідає найбільша тривалість світіння:

при фотографуванні зразків у цьому випадку джерело світла можна не вмикати.

Процедура ідентифікації смуг нуклеїнових кислот полягає у наступному:

після електрофорезу гель фарбують, вимочуючи його у водному розчині барвника (0,5 – 1,0 мкг/мл) упродовж 0,5 – 1,0 год, або вводять EtBr безпосередньо у гель при його полімеризації. В останньому випадку слідкують за рухливістю смуг у гелі, періодично освітлюючи його УФ-лампою. Чутливість методу виявлення нуклеїнових кислот у гелі за допомогою EtBr досить висока – можна спостерігати та фотографувати смуги, які містять 2 нг ДНК. Крім того, EtBr застосовують для фарбування одноланцюгових нуклеїнових кислот (РНК та денатурованої ДНК).

Для цього гель витримують 1 год у 1 мМ MgS04 з додаванням барвника з розрахунку 5 мкг/мл. Зв’язування EtBr з одноланцюговими нуклеїновими кислотами є значно меншим, ніж з дволанцюговими. Тому і інтенсивність флуоресценції буде слабшою.

Бромистий етидій – сильний мутаген та канцероген, тому всі маніпуляції з гелями та розчинами, які містять цей барвник, необхідно проводити в одноразових гумових рукавичках.

2. Акридиновый помаранчевий (АП). Цей барвник також належить до флуоресцентних. З його допомогою можна одночасно розпізнавати у препараті смуги дво- та одноланцюгових нуклеїнових кислот. Інтеркалюючи у дволанцюгові ділянки нуклеїнових кислот, барвник при освітленні ультрафіолетом дає зелену флуоресценцію (l = 530 нм). Водночас електростатичне приєднання АП до одноланцюгових молекул по залишках фосфорної кислоти зумовлює червону флуоресценцію (l = 640 нм). Робоча концентрація АП при фарбуванні гелю становить 30 мкг/мл у 0,01М натрійфосфатному буфері з рН 7. Тривалість фарбування – близько 30 хв. Відмивання фону самого гелю триває 2 – 3 год у 0,1 мМ розчині солі.

3. DAPI (4,6-діамідино-2-феніліндол-2НСl) – флуоресцентний барвник. Ця речовина фарбує ДНК, але не зв'язується з РНК. Барвник флуоресціює при l = 454 нм, однак оптимум збудження його флуоресценції відповідає l = 372 нм.

Агарозні гелі або ПААГ після електрофорезу можна вимочувати упродовж 1 год у розчині DAPI, який містить 0,1 мкг/мл барвника у буфері (5 мМ трис-НСІ з рН 7,2 + 0,01 М NaCl), з наступним відмиванням фону у воді. Чутливість фарбування ДНК DAPI така ж висока, як і у бромистого етидію.

4. Нефлуорисцентні барвники. Виявити та проаналізувати препарати ДНК та РНК у гелі можна також за допомогою ефективних нефлуоресцентних барвників: метиленового синього (МС), толуїдинового синього (ТС), метилового зеленого (МЗ) та піроніну. Залежно від завдання МЗ та піронін можна застосовувати окремо або у комбінації для одночасної ідентифікації молекул ДНК та РНК у вихідному препараті. Характерною особливістю цих барвників є те, що МЗ специфічно фарбує молекули ДНК у блакитний колір і при цьому не взаємодіє з РНК а піронін, навпаки, забарвлює червоним кольором лише молекули РНК. Робоча концентрація барвників становить 0,5 % у суміші оцтової кислоти, метанолу та води (1:1:8). На відміну від флуоресцентних барвників чутливість фарбування нуклеїнових кислот цими барвниками є набагато нижчою. Так, для візуалізації за допомогою нефлуоресцентних барвників смуг у гелі вміст кожної з нуклеїнових кислот має становити не менше ніж 0,3 – 0,5 мкг.

Крім того, недоліком цих барвників є значна тривалість процедури фарбування гелю та подальшого його відмивання.

3.11. Особливості розподілу різних типів молекул нуклеїнових кислот в агарозних гелях під час електрофорезу

1. Фракціонування дво- та одноланцюгових лінійних ДНК.

Електрофоретична поведінка одноланцюгових (РНК, денатурована ДНК) та дволанцюгових лінійних молекул нуклеїнових кислот значною мірою визначається розмірами біополімерів, їхньою конформацією та поруватістю обраного гелю. Наприклад, відносно короткі лінійні дволанцюгові молекули ДНК (приблизно до 5000 пар нуклеотидів) мають жорсткішу структуру, ніж такого самого розміру денатурована одноланцюгова ДНК. Тому при електрофорезі, особливо у низькопористих гелях (наприклад, ПААГ), таким лінійним дволанцюговим фрагментам ДНК складніше проходити крізь сітку гелю, і вони відставатимуть від денатурованих ДНК такої самої довжини. Довгий дволанцюговий фрагмент ДНК (10 000 пар нуклеотидів і більше) в електричному полі стає гнучкішим, і як вуж протискується крізь пори гелю. Одноланцюгова молекула такої самої довжини згортається у хаотичний клубок, розмір якого гальмує її рухливість. У цьому випадку денатурована ДНК при електрофорезі відставатиме від нативної.

Електрофоретична рухливість лінійних молекул ДНК та РНК у гелі зменшується пропорційно зростанню молекулярної маси. Проте ця залежність характерна лише для нуклеїнових кислот з певним діапазоном молекулярної маси. Наприклад, в агарозному гелі (1 %) можна ефективно розділити суміш фрагментів ДНК довжиною приблизно від 600 до 20 000 пар нуклеотидів, тоді як занадто великі для цього гелю біополімери, що складаються з мільйонів пар нуклеотидів, не можуть мігрувати у ньому.

Макромолекули нуклеїнових кислот довжиною понад 20 000 пар нуклеотидів за цих умов рухатимуться з однаковою швидкістю незалежно від їхньої молекулярної маси і утворюватимуть у гелі одну смугу. Це відбувається внаслідок гнучкості довгих молекул ДНК, які звиваючись, проходять крізь пори гелю однаково легко (або важко) незалежно від їхньої довжини. Рухливість занадто малих молекул, для яких пори гелю практично не становлять перешкоди, не залежить від їхніх молекулярних мас, тому ці молекули не можна розділити електрофоретично. Для фракціонування занадто великих та занадто малих макромолекул нуклеїнових кислот, а також денатурованих ДНК та РНК використовують спеціальні системи електрофорезу.

2. Фракціонування кільцевих дволанцюгових ДНК. До складу препаратів вірусних, мітохондріальних та плазмідних ДНК входять молекули, які відрізняються за своєю конформацією: 1) компактні суперспіралізовані дволанцюгові кільця; 2) відкриті кільцеві молекули, які характеризуються збільшенням зовнішніх розмірів; 3) лінійні дволанцюгові фрагменти ДНК. За умов електрофорезу суперспіральна молекула завжди мігрує швидше, ніж відкрита кільцева. Що стосується лінійної молекули ДНК, то залежно від середнього розміру пор гелю, вона може рухатися швидше або повільніше, ніж суперспіралізоване кільце з такою самою молекулярною масою. Для великопористого гелю вирішальним чинником є компактність суперспіралізованої молекули ДНК, для дрібнопористого – більша гнучкість лінійної молекули під дією електричного поля. Тому, наприклад, у 0,6 – 0,8 % агарозному гелі розподіл (починаючи від старту) молекул плазмідної ДНК за конформацією має такий вигляд: відкриті кільцеві молекули – лінійні – суперспіралізовані кільця. Такі самі форми ДНК у 1,4 % гелі розподіляться так:

відкриті кільцеві молекули – суперспіралізовані – лінійні.

3. Фракціонування РНК. Електрофоретична рухливість нативних високополімерних одноланцюгових РНК у нейтральному діапазоні рН має деякі особливості. За "м’яких" умов електрофорезу (рН » 7,5) одноланцюгові фрагменти РНК (ДНК) вдається розділити відносно грубо – лише за значної різниці між їхніми молекулярними масами. Пояснюється це наявністю у молекулі РНК локальних дволанцюгових "шпильок", кількість і розмір яких важко оцінити, а також здатністю цих біополімерів утворювати клубки. Тому для ефективного фракціонування одноланцюгових молекул РНК (ДНК) і точного визначення їхніх молекулярних мас за швидкістю міграції у гелі електрофорез проводять у денатуруючих умовах, тобто у гелі створюють середовище, яке перешкоджає комплементарному спарюванню одинарних ланцюгів нуклеїнових кислот або їхніх ділянок. За цих умов молекули розпрямляються, і це робить залежність швидкості руху від довжини полінуклеотидів більш суворою, дає можливість фракціонувати такі молекули та оцінити їхню молекулярну масу.

3.12. Електрофоретичне визначення концентрації нуклеїнових кислот.

Якщо зразок містить дискретний набір молекул ДНК та РНК різного розміру, то після електрофорезу отримують кілька чітких смуг. Для приблизної оцінки концентрації досліджуваних молекул нуклеїнових кислот порівнюють інтенсивність флуоресценції зразка та стандартних маркерів з відомою концентрацією. Зазвичай на гель наносять різні кількості маркерних нуклеїнових кислот. Важливо, щоб зразки ДНК та РНК порівнювали з відповідними маркерами, оскільки за однакової кількості інтенсивність флуоресценції ДНК та РНК в УФ-світлі після забарвлення EtBr відрізнятиметься. Цей прийом часто використовують, якщо загальний вміст нуклеїнових кислот у зразку невеликий.

3.13. Електрофоретичне визначення молекулярної маси нуклеїнових кислот.

Відстань, на яку мігрують молекули нуклеїнових кислот у гелі, обернено пропорційно залежить від десяткового логарифма їхніх молекулярних мас. На цьому ґрунтується електрофоретичний метод визначення молекулярної маси ДНК і РНК. Щоб точно оцінити молекулярну масу розділених фрагментів нуклеїнових кислот, одночасно проводять електрофорез біополімерів, які тестують та маркерних молекул з відомими молекулярними масами. Набір маркерів має включати весь діапазон досліджуваних молекулярних мас. З огляду на те, що логарифм молекулярної маси маркера лінійно зв’язаний з його електрофоретичною рухливістю (Rf – показник, який дорівнює відношенню відстаней, пройдених маркерною молекулою та барвником), будують графік залежності десяткового логарифма молекулярних мас маркерів (вісь ординат) від Rf (вісь абсцис). З його допомогою знаходять молекулярну масу кожного фрагмента досліджуваного зразка нуклеїнових кислот.

Існує альтернативний варіант оцінки молекулярної маси нуклеїнових кислот.

Оскільки молекулярна маса молекул нуклеїнових кислот пропорційна їхній довжині, можна побудувати стандартну криву залежності відстані, на яку мігрує маркер, від десяткового логарифма довжини цього фрагмента (кількість пар нуклеотидів), а потім визначати розміри фрагментів нуклеїнових кислот у препараті за відстанню, на яку вони перемістилися.

Молекулярну масу нуклеїнових кислот вимірюють у дальтонах (Да) або виражають кількістю пар нуклеотидів (для дволанцюгових) та кількістю нуклеотидів (для одноланцюгових). Так, 1 kilobase (kb) = 1000 пар нуклеотидів дволанцюгової ДНК = 6,6105 дальтон (Да); 1 kb = 1000 нуклеотидів одноланцюгової ДНК = 3,3105 Да; 1 kb = 1000 нуклеотидів одноланцюгової РНК = 3,4105 Да.

Завдання на виконання

1. Зважити 400 мг агарози, помістити її у термостійку колбу або склянку і додати ТВЕ-буфер (1) до одержання об’єму 50 мл. Утворений розчин матиме концентрацію 0,8 %.

2. Нагрівати у відкритій посудині, час від часу ретельно перемішуючи, вміст склянки до повного розчинення агарози.

3. Підготувати форму для заливання гелю та гребінку. Для цього її розміщують на горизонтальній поверхні. Слід уникати навіть незначного нахилу форми, оскільки при заливанні гелю розплавлена агароза утворить шар нерівномірної товщини. За допомогою прищіпок встановлюють гребінку перпендикулярно як до поверхні форми, так і до однієї з її сторін на відстані близько 0,5–1,0 см від старту. Слід встановлювати гребінку таким чином, щоб відстань між нижнім краєм її зубців та дном форми в усіх точках була однаковою і становила 0,5–1,0 мм.



Pages:     | 1 |   ...   | 2 | 3 || 5 | 6 |   ...   | 7 |
Похожие работы:

«НАУКОВІ ПРАЦІ ІНСТИТУТУ БІОЕНЕРГЕТИЧНИХ КУЛЬТУР І ЦУКРОВИХ БУРЯКІВ, випуск 21 АГРОХІМІЯ ТА ГРУНТОЗНАВСТВО 14. Розподіл важких металів у ґрунтах південнополіських ландшафтів Києва та приміської зони / [І.В. Кураєва, А.І. Самчук, Л.Ю. Сорокіна та ін.] // Мінералогічний журнал.– 2010. – 32, № 1. – С. 77-90.15. Соколов О.А. Экологическая безопасность и устойчивое развитие. Кн. 1. Атлас распределения тяжелых металлов в объектах окружающей среды / О.А. Соколов, В.А. Черников. – Пущино : ОНТИ ПНЦ РАН,...»

«Науковий вісник, 2005, вип. 15.6 Звичайно ж, це далеко не всі напрямки, про які варто вести переорієнтацію держави на екологічно спрямовану політику в економічній, природоохоронній, політичній, соціальній сферах, однак варто починати саме з цього сьогодні, і тоді майбутнє країни буде захищено. Література 1. Кислий В.Н., Лапин Е.В., Трофименко Н.А. Экологизация управления предприятием: Монография. – Суми: ВТД Университетская книга, 2002. – 232 с.2. Синякевич І.М., Олійник О.І. Методи...»

«ТОМ 10 ЕКОЛОГІЧНІ ПРОБЛЕМИ РЕГІОНУ ТОМ 10. ЕКОЛОГІЧНІ ПРОБЛЕМИ РЕГІОНУ УДК 543.48 Масенко Я.В., Зайтова О.О., Клімова Я.Г., студенти гр. Х-12 1/9 Науковий керівник: Мещерякова Н.Р., к.х.н., викладач Державний ВНЗ «Дніпропетровський політехнічний коледж», м. Дніпропетровськ, Україна ДОСЛІДЖЕННЯ ВПЛИВУ ЗОВНІШНІХ ФАКТОРІВ НА СТРУКТУРУ ВОДИ Про роль води в житті людини багато написано. Її унікальні фізичні та біологічні властивості ще до кінця не вивчені. Особливо це стосується структури води....»

«УДК 631.811.98: 577.125:635.72 ЕФЕКТИВНІСТЬ ЗАСТОСУВАННЯ РЕГУЛЯТОРА РОСТУ РОСЛИН ГАРТ НА ПОСАДКАХ М’ЯТИ ПЕРЦЕВОЇ Mentha piperita L. В РІЗНІ ЗА АГРОМЕТЕОРОЛОГІЧНИМИ УМОВАМИ РОКИ ЇЇ ВИРОЩУВАННЯ О.П. ПОПОВ кандидат біологічних наук Прилуцька дослідна станція УААН Наведенорезультати вивчення впливу різних доз регулятора росту Гарт на урожайність надземної маси та ефіроолійну продуктивність м’яти перцевої Mentha piperita сорту Удайчанка в різні за метеорологічними показниками роки вирощування. М’ята...»

«Тадеуш Глов’як 300-річчя Вроцлавського університету Tadeusz Gowiak 300-lecie Uniwersytetu Wrocawskiego Міністерство освіти і науки України Львівський національний університет імені Івана Франка Серія «DOCTOR HONORIS CAUSA» Тадеуш ГЛОВ’ЯК 300-річчя Вроцлавського університету Львів • 2003 УДК 378.4.096:548.3(438.26-25)(092)Т.Глов’як ГЛОВ’ЯК Тадеуш. 300-річчя Вроцлавського університету / Укладач Б.Котур. Вступ. сл. Я.Каличака та Б.Котура. Редкол.: І.Вакарчук (голова) та ін. – Львів, 2003. – 28 с....»

«ГРОМАДСЬКА ОРГАНІЗАЦІЯ «ЄВРОПЕЙСЬКА НАУКОВА ПЛАТФОРМА» (за підтримки Торговельно-Промислової Палати України та Iraqi-Ukrainian Business Council) МАТЕРІАЛИ МІЖНАРОДНОЇ НАУКОВО-ПРАКТИЧНОЇ КОНФЕРЕНЦІЇ «АКТУАЛЬНІ ПИТАННЯ СУЧАСНИХ НАУК» 17 листопада 2015 року ТОМ 1 м. Вінниця УДК 001(08) ББК 72.4(4УКР)я 431 H 34 Актуальні питання сучасних наук: матеріали міжнародної науково-практичної конференції H 34 (м.Вінниця, 17 листопада 2015 р.) / відп. за випуск Панасюк М. А. Вінниця : ФОП Рогальська І. О.,...»

«МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ О.С. ВОЛОШИНА М.М. АНТОНЮК МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ПОТЕНЦІЙНИХ ЛІКАРСЬКИХ ЗАСОБІВ КОНСПЕКТ ЛЕКЦІЙ для студентів напряму 6.051401 «Біотехнологія» (спеціальність «Біотехнологія біологічно активних речовин») денної та заочної форм навчання СХВАЛЕНО на засіданні кафедри біотехнології мікробного синтезу Протокол № 12 від 16.03.2010 р. Київ НУХТ 2010 О.С. Волошина, М.М. Антонюк. Методи дослідження потенційних лікарських...»

«Розділ 1. Теоретичні проблеми біології УДК:575.826:504.03:612.59 БІОЛОГІЧНИЙ ЧАС ЛЮДИНИ В УМОВАХ ТЕХНОГЕННОГО НАВАНТАЖЕННЯ (ОГЛЯД) Качанова Ж. С., аспірант, Колісник Н. В., д. б. н., професор Запорізький національний університет Дослідження проблеми адаптації людини та формування біологічних ритмів в умовах техногенного навантаження – вкрай важливе питання сьогодення. У представленому огляді відображено дані про особливості адаптації організму людини до дії техногенних факторів. Наведено дані...»

«Національний лісотехнічний університет України 26. Соболев Н.А. Особо охраняемые природные территории и охрана природы Подмосковья// Научн. чтения, посвящ. памяти Н.Ф. Реймерса: Докл. 4-й конф. в связи с 850летием г. Москвы. – М.: Изд-во МНЭПУ, 1998. – С. 26-56.27. Углубленный обзор расширенной программы работы по биологическому разнообразию лесов. UNEP/CBD/SBSTTA/13/3. 13 November 2007. [Електрон. ресурс]. – Доступний з:...»

«УДК 712.253:541.54(477.44) ОЦІНКА СУЧАСНОГО СТАНУ ДЕНДРОФЛОРИ ПАРКІВ М. ВІННИЦІ Н.О. СИПЛИВА, аспірантка* Досліджено дендрофлору парків відповідно до умов навколишнього середовища та дії екологічних факторів. Вказана кількісна видова характеристика дендрофлори за основними показниками інтродукції. Декоративна ознака, дендрофлора, зимостійкість, інтродукція, парк, мегатрофи, мезофіти. Інтродукція деревних видів рослин, що значно збагатила флору на території України в тому числі і Вінничини,...»




Продажа зелёных и сухих саженцев столовых сортов Винограда (по Украине)
Тел.: (050)697-98-00, (067)176-69-25, (063)846-28-10
Розовые сорта
Белые сорта
Чёрные сорта
Вегетирующие зелёные саженцы


 
2013 www.uk.x-pdf.ru - «Безкоштовна електронна бібліотека»