WWW.UK.X-PDF.RU

БЕЗКОШТОВНА ЕЛЕКТРОННА БІБЛІОТЕКА - Книги, видання, автореферати

 
<< HOME
CONTACTS




Продажа зелёных и сухих саженцев столовых сортов Винограда (по Украине)
Тел.: (050)697-98-00, (067)176-69-25, (063)846-28-10
Розовые сорта
Белые сорта
Чёрные сорта
Вегетирующие зелёные саженцы

Продажа зелёных и сухих саженцев столовых сортов Винограда (по Украине)
Тел.: (050)697-98-00, (067)176-69-25, (063)846-28-10
Розовые сорта
Белые сорта
Чёрные сорта
Вегетирующие зелёные саженцы
Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |

«ЗАТВЕРДЖУЮ Ректор С.В. Іванов (Підпис) «» 2014 р. МОЛЕКУЛЯРНА БІОТЕХНОЛОГІЯ МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ до вивчення дисципліни та виконання контрольної роботи для студентів спеціальностей ...»

-- [ Страница 3 ] --

2. Електроосмос (електроендосмос). Це явище зумовлено виникненням відносного заряду між молекулами води в буфері та поверхнею носія. Іонізація груп носія та поверхнева адсорбція іонів буфера зазвичай призводять до утворення із молекул води позитивно заряджених іонів гідроксонію (Н3О+), які рухаються до катода, захоплюючи розчинені нейтральні речовини та прискорюючи рух катіонів. Швидкість руху аніонів при цьому знижується. Ці ефекти важливо враховувати при визначенні ізоелектричної точки речовини, зокрема білків. Крім того, при електрофракціонуванні в агарозному гелі нуклеїнових кислот ендосмос, спрямований у протилежний бік, може суттєво погіршити розділення цих молекул.

3. Молекулярне сито. Властивість молекулярного сита має напівжорсткий носій – гель, який сприяє ефективному розділенню суміші заряджених макромолекул (зокрема, білків, нуклеїнових кислот), різних за формою, розміром та електрофоретичною рухливістю. Гель – це концентрований розчин полімеру, в якому молекули хаотично переплетені, а у деяких місцях зшиті хімічними зв’язками та розподілені по всьому об’єму гелю з утворенням просторової сіткоподібної структури, кожна комірка якої заповнена буфером. Ця сітка є певною "арматурою" і надає конструкції незвичну для рідин жорсткість. Основну масу гелю становить буфер, а на частку полімерної "арматури" припадає лише декілька відсотків. Залежно від вимог фракціонування молекул розмір пор цих гелей можна змінювати у певних межах. Принцип дії молекулярного сита полягає у тому, що великі макромолекули зазвичай рухаються крізь нього тим повільніше, чим меншим є розмір пор, який визначається кількістю поперечних зшивок у гелі.

3.6. Обладнання для електрофорезу нуклеїнових кислот в агарозному гелі.

Гель-електрофорез широко застосовують насамперед як аналітичний метод. Він дає змогу розділити суміші речовин з однаковими зарядами, але з незначними відмінностями у масі молекул. Роздільна здатність гельелектрофорезу виявилася настільки високою, що за певних умов навіть невеликі фрагменти нуклеїнових кислот, які відрізняються лише на один нуклеотид, чітко відокремлюються один від одного у вигляді смуг, що легко розпізнаються. Характерною перевагою цих носіїв є те, що вони значно (у тисячі разів) ослаблюють під час електрофорезу такі негативні ефекти, як адсорбція, електроосмос та розширення зон у результаті дифузії.

Залежно від розміщення носія для електрофоретичного фракціонування іонізованих молекул розрізняють вертикальний та горизонтальний електрофорез.

Останній варіант найчастіше використовують для аналітичного та препаративного електрофорезу нуклеїнових кислот. Перевагами горизонтального електрофорезу є: 1) можливість використання геля з низькою концентрацією агарози, оскільки весь гель підтримується у горизонтальному положенні; 2) можливість приготування геля у вигляді пластинок різних розмірів; 3) менша викривленість смуг нуклеїнових кислот під час електрофорезу; 4) простота маніпуляцій з гелем.

Обладнання, необхідне для горизонтального електрофорезу нуклеїнових кислот, складається із джерела живлення та електрофоретичного блока. Джерело живлення генерує стабілізований постійний струм і має системи контролю напруги та сили струму на виході. Для роботи з низькою напругою застосовують джерела живлення з вихідною напругою до 500 В і силою струму до 150 мА. Вони забезпечують або постійну напругу, або постійну силу струму.

До складу електрофоретичного блока входять електроди, буферні камери, опора для носія. Можна використовувати електроди із нержавіючої сталі, але оскільки деякі буфери спричиняють корозію, то бажано застосовувати платинові електроди.

Пластину з носієм розміщають на опорі таким чином, щоб гель був розташований під поверхнею електрофорезного буфера, товщина шару якого над агарозним гелем має становити близько 1 – 2 мм. За такого розташування носія опір гелю електричному струму мало відрізняється від опору буфера, тому крізь гель проходить значна частина струму і таким чином забезпечується висока ефективність розділення іонізованих молекул.

3.7. Агарозний гель для електрофорезу нуклеїнових кислот.

Для електрофорезу нуклеїнових кислот використовують здебільшого два типи гелів – 5-20 % поліакриламідні (ПААГ) та агарозні (0,1 – 2 %). ПААГ застосовують для розділення порівняно низькополімерних молекул, наприклад олігонуклеотидів, низькомолекулярних фрагментів ДНК та деяких типів РНК, розмір молекул яких становить у середньому 10 – 1500 пар нуклеотидів.

Електрофоретичне фракціонування більших молекул – плазмід, РНК вірусів, великих рестриктів ДНК, високополімерних молекул геномної ДНК довжиною від 100 до 50 000 пар нуклеотидів проводять в агарозних гелях.

Агароза – це очищена фракція природного полісахариду агару, який отримують з морських водоростей. Для електрофорезу агарозу поставляють у вигляді ліофілізованого порошку. Препарати агарози відрізняються за своїми властивостями, зокрема вмістом шкідливих домішок (наприклад, сульфатонових полісахаридів) та впливом на характер фракціонування нуклеїнових кислот.

Агарозу за температурою плавлення поділяють на легкоплавку, з нормальною і високою температурами плавлення. Легкоплавку агарозу (tпл » 65 °С) використовують для роботи з термолабільними зразками, агарозу з високою температурою плавлення – для високовольтного електрофорезу. Найчастіше для гель-електрофорезного аналізу нуклеїнових кислот застосовують агарозу з температурою плавлення близько 90 °С.

Готують гелі виключно на електрофоретичних буферах, оскільки середовище, в якому відбувається електрофорез, має добре проводити електричний струм. Цими ж буферами заповнюють і кювету апарата для електрофорезу. Зазвичай наважку агарози розчиняють у буфері для електрофорезу, нагріваючи її до кипіння у мікрохвильовій печі або на бані з киплячою водою. За температури 84 – 96 °С полімер плавиться і утворює з оточуючим водним середовищем однорідну прозору рідину. Гелеутворення відбувається при охолодженні гарячого розчину агарози, який застигає за температури близько 40 °С (легкоплавка агароза утворює гель за температури 30 °С). За цієї температури навіть 0,4 % агарозні розчини утворюють міцні гелі.

Перед тим, як залити гель, гарячий розчин агарози охолоджують до температури 50 °С, щоб не пошкодити апарат для електрофорезу.

За розміром пор гелі поділяють на велико- та дрібнопористі. Середню величину пор агарозного гелю, яка безпосередньо залежить від концентрації гелеутворювача, слід враховувати при проведенні електрофракціонування молекул нуклеїнових кислот. Під впливом електричного поля поведінка одноланцюгових (РНК, денатурована ДНК) та дволанцюгових молекул (лінійні фрагменти ДНК, кільцеві ДНК різних форм – ковалентно замкнені або відкриті кільцеві) нуклеїнових кислот у гелях з низькою та високою концентрацією агарози може суттєво відрізнятися.

Зазвичай вибір концентрації гелеутворювача залежить від розміру молекул біополімерів та мети проведення електрофорезу. Що більшим є розмір молекул нуклеїнових кислот, то меншу концентрацію гелеутворювача застосовують, хоча у певних випадках беруть до уваги й інші фактори.

3.8. Підготовка та нанесення зразків нуклеїнових кислот в агарозний гель.

Для отримання дискретних смуг макромолекул потрібно насамперед визначити максимальну кількість нуклеїнових кислот, яку можна внести у лунку.

Це залежить від кількості макромолекул у пробі, їхніх розмірів та методу подальшої візуалізації у гелі. Так, зазвичай для електрофоретичного аналізу простого набору молекул нуклеїнових кислот (наприклад, вихідних препаратів) за наявності низьких концентрацій EtBr у лунку довжиною 0,5 см вносять 0,2 – 0,5 мкг нуклеїнових кислот. За цих умов під час електрофоретичного фракціонування у агарозних гелях можна бачити смугу, яка містить близько 10 нг молекул нуклеїнових кислот. Гель буде перевантажений, якщо після електрофорезу в окремій смузі виявиться понад 100 нг нуклеїнових кислот. У цьому випадку вона буде розпливчатою та матиме шлейф. Такий дефект можна часто спостерігати при фракціонуванні великих фрагментів ДНК. Проте проби, що містять велику кількість фрагментів ДНК різних розмірів (наприклад, рестрикти ДНК рослин та ссавців), можна наносити у лунку в кількості 5 – 10 мкг без суттєвого зниження роздільної здатності. Наступний етап полягає у змішуванні водних зразків біополімерів з буфером для нанесення проб. Цей розчин містить речовини, тяжчі за воду (наприклад, гліцерин, сахарозу, фікол), та відповідні барвники. Присутність 5 – 10 % гліцерину або 5 – 10 % сахарози у водному зразку нуклеїнових кислот необхідна для нашарування проби у лунки гелю, попередньо заповнені електрофоретичним буфером. Крім того, для слідкування за ходом електрофорезу до складу сумішей часто включають 0,025 % лідуючих барвників, наприклад бромфенолового синього (руйнується у лузі), ксиленціанолу (руйнується у лузі, рухливість нижча, ніж у бромкрезолового та бромфенолового синього), бромкрезолового зеленого (стійкий у різних буферах), які рухаються у тому напрямку, що й нуклеїнові кислоти. Підготовлені зразки нуклеїнових кислот обережно вносять у лунки гелю самплером у вигляді вузької смуги. Оскільки всі нуклеїнові кислоти заряджені негативно і рухаються в одному напрямку – до аноду, то лунки із зразками потрібно розташовувати якомога далі від цього електрода, щоб дати можливість макромолекулам різної довжини пройти найбільшу відстань і утворити у гелі дискретні смуги. Спостерігаючи за рухом барвників під впливом електричного поля, можна отримати деяке уявлення про поведінку системи під час електрофорезу. Так, у 1 % агарозному гелі ксиленціанол рухається з фрагментами ДНК розміром 4000 пар нуклеотидів, тоді як бромфеноловий синій з фрагментами ДНК близько 300 пар нуклеотидів. Коли, наприклад, бромфеноловий синій досягає кінця гелевої пластини, електрофорез зупиняють. Проте слід ураховувати, що у великопористих гелях агарози малі фрагменти ДНК можуть обганяти бромфеноловий синій.

Маркерні молекули. Для порівняльного електрофоретичного аналізу досліджуваних біополімерів зазвичай використовують набір молекул того самого типу відомої довжини, які вносять у лунку, розташовану поблизу краю гелевої пластинки (або у дві лунки, розташовані з різних боків пластинки). Для РНК з цією метою застосовують рРНК, тРНК, 5S РНК та інші РНК відомого розміру.

Для ДНК роль маркерів зазвичай виконують фрагменти відомої довжини, отримані при обробці добре вивченої ДНК певними рестриктазами. Такими є, наприклад, HindІІІ- або ЕсоRI-рестрикти ДНК фага l тощо.

3.9. Електрофоретичне фракціонування молекул нуклеїнових кислот.

Після нанесення зразка вмикають джерело живлення, підтримуючи відповідну напругу протягом усього процесу розділення. Навіть за наявності стабілізованих джерел живлення необхідно постійно контролювати роботу приладу, оскільки у випадку недостатньо ретельної підготовки гелевого носія можливе перегрівання. Зазвичай електрофорез нуклеїнових кислот триває 1 – 2 год. По його закінченні спочатку вимикають джерело живлення, а потім виймають гелеву пластинку. У деяких випадках для запобігання дифузії смуг нуклеїнових кислот під час їх подальшого фарбування застосовують фіксацію молекул осадженням. Для цього гелеву пластинку спочатку вимочують у 70 % етанолі, і лише потім нуклеїнові кислоти візуалізують.

3.10. Візуалізація нуклеїнових кислот в агарозних гелях.

Більшість біологічних сполук, зокрема нуклеїнові кислоти, не мають забарвлення. Локалізацію цих біополімерів у гелі можна виявити за допомогою обробки останнього барвниками, які специфічно зв’язуються з молекулами зразка.

Найпоширенішими флуоресцентними та нефлуоресцентними барвниками нуклеїнових кислот є такі:

1. Бромистий етидій (EtBr). Цей флуоресцентний барвник має позитивний заряд, завдяки чому він взаємодіє з фосфатними групами нуклеїнових кислот.



Pages:     | 1 | 2 || 4 | 5 |   ...   | 7 |
Похожие работы:

«МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ, МОЛОДІ ТА СПОРТУ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ ЗАТВЕРДЖУЮ Ректор Іванов С.В. «_» _ 2012 р. ЗАГАЛЬНА ТЕХНОЛОГІЯ ХАРЧОВИХ ВИРОБНИЦТВ ТА ТЕХНОЛОГІЯ ГАЛУЗІ МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ до вивчення дисципліни для студентів за напрямом підготовки 6.050503 «Машинобудування» (обладнання переробних і харчових виробництв, спеціалізація – обладнання хлібопекарських виробництв) денної форми навчання Реєстраційний номер Схвалено на засіданні кафедри електронних...»

«УДК 631.16:636.932.3 К.О. Свириденко, аспірант* Інститут тваринництва УААН ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ВИРОБНИЦТВА ПРОДУКЦІЇ НУТРІЇВНИЦТВА Постановка проблеми. З 1999 р. умови утримання та забою хутрових звірів на фермах Європи регламентуються вимогами Рекомендацій Постійної комісії Ради Європи з дотримання Європейської конвенції захисту тварин, яких розводять на фермах [6]. В сучасних умовах розвитку суспільства та на виконання загального державного курсу щодо входження до Євросоюзу і адаптації...»

«49 Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія, 2014, № 4 УДК 577.121.2 Н. РАКША, О. САУК,. КОНОПЕЛЬНЮК, Л.І. ОСТАПЕНКО Навчально-наукови центр «Інститут біології» Київського національного університету ім. Тараса Шевченка, м. Київ nkudina@ukr.net Пептиди як основа для створення фармакологічних препаратів спрямованої дії Останні десятиліття охарактеризувалися бурхливим розвитком пептидоміки – одного з нових напрямів ізико-хімічної біології, в межах якого вивчають склад, ункції, механізми...»

«УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ДЕРЖАВНИЙ НИКІТСЬКИЙ БОТАНІЧНИЙ САД УДК 581.412:581.524.342 (477.75) Подорожний Сергій Миколайович Пірогенні сукцесії кримськососнових лісів південного макросхилу Головного пасма Кримських гір 03.00.05 – ботаніка Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук Ялта – 1999 Дисертація є рукопис Робота виконана у відділі флори та рослинності Державного Никітського ботанічного саду УААН Науковий керівник: доктор біологічних наук,...»

«30 РОЗДІЛ 2. ЗООЛОГІЯ ТА ЕКОЛОГІЯ ТВАРИН УДК 564: 574.5 ЗНАЧЕННЯ ДРЕЙСЕНИ У ФОРМУВАННІ ІНДИВІДУАЛЬНИХ КОНСОРЦІЙ Домбровський К.О., к.б.н., доцент Запорізький національний університет Розглядаються питання загальнобіологічного характеру, що пов’язані з утворенням та функціонуванням консорції водних безхребетних, у яких детермінуючим центром є Dreissena. З’ясовано середовищеутворююче значення дрейсени у формуванні супутніх видів-консортів. Ключові слова: дрейсена, двостулкові молюски, консорція,...»

«Національний лісотехнічний університет України УДК 631.42 Викл. М.М. Горбач, канд. с.-г. наук; викл. В.М. Іваницька, канд. біол. наук – Закарпатський лісотехнічний коледж ЕКОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ ОСНОВНИХ ПЛОДОВИХ КУЛЬТУР І ПІДБІР ДЛЯ НИХ ҐРУНТІВ У ЗАКАРПАТТІ Показано екологічні особливості основних плодових культур: яблуні, груші, сливи, вишні, черешні, абрикоса, персика, горіха. Наведено коротку характеристику бурих лісових, дерново-буроземних і буроземно-опідзолених ґрунтів. З метою отримання...»

«Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія, 2010, № 4 35 УДК 547.466: 578/ 579: 620.169.462.21: 616 — 005.6: 612.6.052.4 Н.В.ЗАІЧКО Науково дослідний інститут реабілітації інвалідів Вінницького національного медичного університету ім. М.І.Пирогова Рівні гомоцистеїну, цистеїну та гідрогенсульфіду в плазмі крові пацієнтів з тромбозами глибоких вен нижніх кінцівок: зв’язок з поліморфізмом С677Т в гені метилентетрагідрофолатредуктази З кожним роком з’являється все більше даних про те, що...»

«See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/262376344 Вуглець, клімат та землеуправління в Україні: лісовий сектор (Carbon, climate, and land-use in Ukraine: Forest sector) Book · May 2014 READS 5 authors, including: Anatoly Shvidenko Dmitry Schepaschenko International Institute for Applied Systems. International Institute for Applied Systems. 176 PUBLICATIONS 3,972 CITATIONS 85 PUBLICATIONS 573 CITATIONS SEE PROFILE...»

«УДК 634.11 : 663.293 : 663.1 : 653 ЗАХИСТ ПЛОДОВОГО РОЗСАДНИКА ВІД ВІЧКОВОЇ ГАЛИЦІ ТА ОСОБЛИВОСТІ ЇЇ БІОЛОГІЇ Й ШКІДЛИВОСТІ В ЦЕНТРАЛЬНОМУ ЛІСОСТЕПУ УКРАЇНИ Й.Т. ПОКОЗІЙ, доктор біологічних наук, Ю.П. ЯНОВСЬКИЙ, доктор сільськогосподарських наук, І.С. КРАВЕЦЬ, кандидат сільськогосподарських наук, О.Г. СУХОМУД, кандидат сільськогосподарських наук Національний аграрний університет Мліївський інститут садівництва ім. Л.П. Симиренка УААН Уманський державний аграрний університет Наведено результати...»

«Практика радіовимірювань УДК 621.317.07.089 РАДІОМЕТРИЧНА ОЦІНКА ЯКОСТІ ДІЕЛЕКТРИЧНИХ МАТЕРІАЛІВ Яненко О. П., д.т.н., професор; Куценко В. П.,к.т.н., докторант; Михайленко С. В., студент Національний технічний університет України «Київський політехнічний інститут», Київ, Україна RADIOMETRIC QUALITY EVALUATION OF DIELECTRIC MATERIALS Yanenko O. P., Doc. Of Sci (Technics), Prof.; Kutsenko V. P. Cand. Of Sci (Technics); Mikhailenko S. V., student National Technical University of Ukraine «Kyiv...»




Продажа зелёных и сухих саженцев столовых сортов Винограда (по Украине)
Тел.: (050)697-98-00, (067)176-69-25, (063)846-28-10
Розовые сорта
Белые сорта
Чёрные сорта
Вегетирующие зелёные саженцы


 
2013 www.uk.x-pdf.ru - «Безкоштовна електронна бібліотека»