WWW.UK.X-PDF.RU

БЕЗКОШТОВНА ЕЛЕКТРОННА БІБЛІОТЕКА - Книги, видання, автореферати

 
<< HOME
CONTACTS




Продажа зелёных и сухих саженцев столовых сортов Винограда (по Украине)
Тел.: (050)697-98-00, (067)176-69-25, (063)846-28-10
Розовые сорта
Белые сорта
Чёрные сорта
Вегетирующие зелёные саженцы

Продажа зелёных и сухих саженцев столовых сортов Винограда (по Украине)
Тел.: (050)697-98-00, (067)176-69-25, (063)846-28-10
Розовые сорта
Белые сорта
Чёрные сорта
Вегетирующие зелёные саженцы
Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |

«ЗАТВЕРДЖУЮ Ректор С.В. Іванов (Підпис) «» 2014 р. МОЛЕКУЛЯРНА БІОТЕХНОЛОГІЯ МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ до вивчення дисципліни та виконання контрольної роботи для студентів спеціальностей ...»

-- [ Страница 2 ] --

Метод електрофорезу ґрунтується на тому, що багато важливих макромолекул здатні іонізуватися, і тому можуть існувати у розчині у зарядженій формі як катіони (+) або аніони (–). Крім того молекули з близькими за величиною зарядами, але різні за молекулярними масами відрізняються за величиною відношення заряду до маси. Це впливає на характер розподілу іонів під час їхньої міграції у розчині під дією електричного поля.

Швидкість руху катіонів до катоду та аніонів до аноду залежить переважно від співвідношення між рушійною силою електричного поля, яке діє на заряджені іони, та силами тертя і електростатичними силами, здатними уповільнювати рух макромолекул. Щоб забезпечити проведення електричного струму зазвичай використовують один і той самий буфер для насичення носія та розчинення зразка. У розчині струм між електродами зумовлений рухом іонів буфера та зразка, а у ланцюзі – електронами. Струм у ланцюзі підтримується за рахунок електролізу, що відбувається на електродах, кожний з яких занурений у велику буферну камеру. Під час електролізу на катоді утворюються іони гідроксилу та молекулярний водень, а на аноді – молекулярний кисень та іони водню.

Утворення на катоді гідроксильних іонів збільшує дисоціацію компонента буферної суміші, який є слабкою кислотою. Внаслідок нього зростає кількість іонів, які проводять струм до анода. На аноді іони з’єднуються з протонами, при цьому знову утворюється слабка кислота, а електрони потрапляють в електричний ланцюг. Якщо вимкнути електричне поле до того, як іони дослідної суміші досягнуть електродів, то заряджені молекули цієї суміші розподіляться на носії відповідно до їхньої електрофоретичної рухливості.

Таким чином, електрофорез – це незавершена форма електролізу.

3.2. Властивості нуклеїнових кислот, що впливають на електрофорез.

1. Заряд. Зазвичай рухливість багатьох іонізованих молекул зростає із збільшенням сумарного заряду, величина якого залежить від рН. Проте фракціонування електрофорезом молекул нуклеїнових кислот відрізняється від електрофоретичного розділення, наприклад, білків, що зумовлено самою природою цих біополімерів. На відміну від білкових молекул, електричний заряд яких залежить від рівня іонізації окремих доменів молекули під впливом рН, нуклеїнові кислоти мають негативний і значний за величиною сумарний електричний заряд, який зумовлений дисоціацією численних залишків фосфорної кислоти. Величина цього заряду майже не залежить від рН оточуючого середовища, а величина відношення заряду до маси є практично однаковою для всіх молекул нуклеїнових кислот. Тому фракціонування нуклеїнових кислот електрофорезом зазвичай відбувається за рахунок відмінностей за розмірами молекул, а не за їхніми зарядами. Лише короткі олігонуклеотиди розділяють за зарядом основ, який стає помітним за кислих значень рН (наприклад, при застосуванні натрій-цитратного буфера з рН 3,5).

2. Розміри. За певних умов електрофорезу великі макромолекули демонструють меншу рухливість в електричному полі порівняно з малими. Це пов’язано із збільшенням величини сили тертя та електростатичних взаємодій між великими молекулами та оточуючим середовищем. Що довшою є молекула, то більший заряд, більша рушійна сила, але і більший опір середовища. Опір збільшується зі зростанням довжини швидше, ніж сила, тому швидкість руху макромолекули зменшується зі збільшенням її довжини.

3. Вторинна структура. Молекули однакового розміру, але різної форми, наприклад, фібрилярні і глобулярні білки або препарати плазмідної ДНК, які містять суперспіралізовані, відкриті кільцеві та лінійні молекули, мають різну електрофоретичну рухливість. Особливо помітна різниця у швидкості міграції таких макромолекул у в’язкому середовищі (наприклад, у гелі). Це явище зумовлено відмінностями у силі тертя та електростатичній взаємодії, тобто залежить від розміру пор гелю, сили струму та іонної сили буфера.

3.3. Електричне поле.

На розділення іонів у електричному полі впливають сила струму (І, А), напруга (V, В) та опір (R, Ом), пов’язані між собою законом Ома: І = V/R.

1. Сила струму. Оскільки у розчині струм між електродами зумовлений виключно направленим рухом іонів буфера та зразка, то швидкість їхньої міграції прямо пропорційна силі струму. Довжина шляху, який долають іони, пропорційна часу пропускання струму. Тому сила струму під час електрофорезу не повинна змінюватися, тобто струм має бути постійним.

2. Напруга. Як випливає із закону Ома, швидкість міграції заряджених молекул пропорційна падінню напруги у підтримуючому середовищі (носії) – градієнту напруги (В/см), який відображує співвідношення між прикладеною напругою та довжиною носія. Залежно від поставлених завдань використовують як низькі (100 – 500 В), так і високі (500 – 10000 В) напруги з градієнтами від 20 до 200 В/см відповідно. Високі напруги застосовують переважно для розділення низькомолекулярних речовин та зниження дифузності їхніх смуг.

Електрофоретичне фракціонування нуклеїнових кислот у гелі здійснюють зазвичай низьковольтним форезом. Для цього використовують напругу у діапазоні 20 – 200 В з градієнтом електричного поля у гелі до 0,5 – 2,0 В/см, але не більше ніж 5 В/см. За більших значень полімерні молекули нуклеїнових кислот деформуються та "продавлюються" крізь пори гелю незалежно від своєї маси, і, як наслідок, не можуть бути розділені електрофорезом. Швидкість міграції макромолекул у гелі середньої поруватості під час електрофорезу тим більша, чим вищою є напруга на електродах, однак ефективність розділення молекул за цих умов суттєво знижується. Тому електрофракціонування нуклеїнових кислот за підвищених значень напруги (понад 100 В) застосовують лише для попереднього аналізу. Для точного розділення фрагментів нуклеїнових кислот проводять електрофорез при напрузі 20 В упродовж 20 год. Проте у багатьох випадках така точність не потрібна і тому найчастіше у молекулярнобіотехнологічній практиці оптимальною робочою напругою є 80 – 100 В, а тривалість електрофорезу становить 1 – 2 год.

3. Опір. Швидкість руху іонів обернено пропорційно залежить від опору, який своєю чергою залежить від типу і розмірів носія та від іонної сили буфера.

Опір зростає із збільшенням довжини шару носія та зменшується за зростання його ширини та концентрації буферних іонів. Під час електрофорезу виділяється тепло, величина якого за одиницю часу дорівнює І2R (BT). За постійної напруги таке нагрівання призводить до зменшення опору, зростання сили струму та посиленого випаровування розчинника. Всі ці процеси негативно впливають на роздільну здатність методу. Тому для забезпечення ефективного розділення суміші молекул застосовують стабілізовані джерела живлення, які підтримують на постійному рівні або напругу, або силу струму, незважаючи на зміни опору за температурних флуктуацій. Випаровування можна звести до мінімуму, якщо апарат прикрити пластиною із ізолюючого матеріалу.

3.4. Електрофоретичний буфер.

Важливим компонентом будь-якої електрофоретичної системи є буфер, який забезпечує і стабілізує рН носія, а також впливає на швидкість міграції речовин. При виборі буфера насамперед звертають увагу на такі параметри, як склад, концентрація та рН.

1. Склад буферів. Для фракціонування молекул різної хімічної природи найчастіше використовують форміатний, ацетатний, цитратний, вероналовий, фосфатний, трис, ЕДТА та піридиновий буфери. Для розділення, наприклад, вуглеводів, часто застосовують боратні буфери, перевага яких полягає у тому, що вони утворюють з ними заряджені комплекси. До буферів, які традиційно використовують у неденатуруючих умовах електрофорезу нуклеїнових кислот, входять ТАЕ (трис-ацетат-ЕДТА), ТРЕ (трис-фосфат-ЕДТА) та ТВЕ (трис-боратЕДТА).

Електрофоретичні буфери відрізняються за величиною буферної ємності. Під час електрофорезу іони буфера мігрують у напрямку електродів, і з часом катод закислюється, а анод стає лужним. За тривалого електрофорезу буферні розчини з низькою ємністю швидко виснажуються і потребують періодичної рециркуляції в апараті. Для зручності зазвичай використовують буферну систему з високою ємністю. ТРЕ та ТВЕ забезпечують ефективне розділення молекул нуклеїнових кислот та мають значно більшу буферну ємність, аніж ТАЕ-буфер та лужний буфер (розчин NaOH).

Електропровідність багатьох буферів для електрофорезу нуклеїнових кислот зумовлена наявністю іонів натрію, концентрація яких становить 0,02 – 0,04 М. Ця величина може бути певним орієнтиром при виборі буфера іншого складу. Крім того, майже в усі електрофоретичні буферні системи додають ЕДТА до концентрації 1 – 8 мМ. Це дає змогу не тільки блокувати активність нуклеаз, а й запобігти осадженню нуклеїнових кислот двовалентними металами, особливо у лужному середовищі. Оскільки буфери є розчинниками для зразків, то деяка дифузія проби неминуча. Це особливо помітно для малих молекул, таких як амінокислоти, вуглеводи, низькополімерні білки та олігонуклеотиди. Дифузію можна звести до мінімуму, якщо наносити зразки у вигляді вузьких смуг і у помірних кількостях, застосовувати високу напругу та якнайшвидше проводити розділення, а по його завершенні швидко фіксувати зразки та візуалізувати молекули відповідними аналітичними методами.

2. Концентрація буфера. Із збільшенням іонної сили буфера компонент струму, зумовлений перенесенням іонів буфера, зростатиме, а частка струму за рахунок іонів зразка, зменшуватиметься. Таким чином, швидкість міграції молекул зразка уповільнюється. За високої іонної сили буфера сумарний струм збільшується, і як наслідок, зростає кількість тепла, що виділяється. За низької іонної сили струм, зумовлений перенесенням іонів буфера, зменшується, а частка струму за рахунок іонів зразка збільшується. Таким чином, міграція молекул зразка прискорюється. У буфері з низькою іонною силою сумарна сила струму та виділення тепла зменшуються, проте зростає дифузія, і, як наслідок, – погіршується роздільна здатність порівняно з високою іонною силою.

Таким чином, при виборі іонної сили електрофорезного буфера необхідно знайти певний компроміс. Зазвичай використовують іонні сили буферів з концентрацією від 0,05 до 0,1 М. Зокрема для електрофорезного фракціонування нуклеїнових кислот оптимальна іонна сила буферів становить 50 мМ.

3. рН. Для речовин, здатних повністю дисоціювати, наприклад, неорганічних солей, величина рН не має значення, однак для багатьох органічних сполук (зокрема, білків) рН визначає ступінь іонізації молекули. Так, з підвищенням величини рН іонізація органічних кислот зростає, а основ – зменшується, таким чином, змінюється їхня електрофоретична рухливість.

Величина рН практично не впливає на іонізацію нуклеїнових кислот. Зазвичай електрофоретичне фракціонування нуклеїнових кислот проводять у буферах з рН від 7,5 до 8,0.

3.5. Носії при електрофорезі.

Зазвичай як носії при електрофорезі іонізованих молекул різного походження використовують відносно інертні речовини – аркуші хроматографічного паперу або ацетату целюлози, тонкі шари окису кремнію або алюмінію, крохмальні, агарозні та поліакриламідні (ПААГ) гелі. Однак їхній склад впливає на рухливість речовин, тому вибір носія залежить від природи зразка.

1. Адсорбція. Адсорбція – утримування молекул носієм-адсорбентом. Це призводить до зменшення швидкості міграції та розмивання плям зразка.

Найбільшу адсорбційну здатність має папір. Щоб усунути цю небажану властивість, електрофракціонування молекул нуклеїнових кислот та білків зазвичай проводять у ПААГ та гелях агарози.



Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 7 |
Похожие работы:

«НАУКОВІ ПРАЦІ ІНСТИТУТУ БІОЕНЕРГЕТИЧНИХ КУЛЬТУР І ЦУКРОВИХ БУРЯКІВ, випуск 21 БІОТЕХНОЛОГІЯ УДК 581.143.6: 635.21 БОРОДАЙ В.В., кандидат біол. наук, доцент, КЛЯЧЕНКО О.Л., кандидат біол. наук, доцент Національний університет біоресурсів і природокористування України e-mail: veraboro@gmail.com ОСОБЛИВОСТІ ІНДУКОВАНОГО МОРФОГЕНЕЗУ ТА РЕГЕНЕРАЦІЇ ГЕНОТИПІВ SOLANUM TUBEROSUM L. УКРАЇНСЬКОЇ СЕЛЕКЦІЇ Досліджено особливості морфогенетичних реакцій Solanum tuberosum L. у культурі in vitro для низки...»

«Науковий вісник НЛТУ України. – 2009. – Вип. 19.6 22. Афанасьєва М.М., Великанов Л.Л. Участие микромицетов в биодеструкции лесного опада и их влияние на прорастание семян ели // Микология и фитопатология. – 1989. – 23.– Вып. 4. – С. 305-309.23. Рипачек В. Биология дереворазрушающих грибов. – М. : Изд-во Лесн. пром-сть, 1967. – 276 с. УДК 631.524+712.41 Ст. наук. співроб. А.І. Івченко, канд. с.-г. наук; ст. наук. співроб. І.М. Пацура, канд. с.-г. наук; ст. наук. співроб. А.С. Мельник; інж. О.С....»

«Тадеуш Глов’як 300-річчя Вроцлавського університету Tadeusz Gowiak 300-lecie Uniwersytetu Wrocawskiego Міністерство освіти і науки України Львівський національний університет імені Івана Франка Серія «DOCTOR HONORIS CAUSA» Тадеуш ГЛОВ’ЯК 300-річчя Вроцлавського університету Львів • 2003 УДК 378.4.096:548.3(438.26-25)(092)Т.Глов’як ГЛОВ’ЯК Тадеуш. 300-річчя Вроцлавського університету / Укладач Б.Котур. Вступ. сл. Я.Каличака та Б.Котура. Редкол.: І.Вакарчук (голова) та ін. – Львів, 2003. – 28 с....»

«Збірник №36 Вип.4 Захист рослин наукових праць ВНАУ 2012 При обробці даних використовували методи математичної статистики [4]. Результати досліджень та їх обговорення. Ефективність мікробних препаратів вивчали в порівнянні з хімічним фундазолом. Результати дослідів (табл. 1) свідчать, що біологічні препарати не тільки не поступалися хімічному препарату фундазолу, а й перевищували його за багатьма показниками. Дані обліку засвідчують достовірні переваги мікробного препарату хетоміка над іншими...»

«Випуск 173. Том 185 УДК 577.156; 612.015.349 Чорна В. І., Лянна О. Л., Бразалук О. З. ІНІЦІАЦІЯ АДАПТИВНОЇ ВІДПОВІДІ КЛІТИН ГОЛОВНОГО МОЗКУ НА ВПЛИВ НИЗЬКИХ ДОЗ ІОНІЗУЮЧОГО ВИПРОМІНЮВАННЯ Метою даної роботи було дослідження адаптивної відповіді клітин головного мозку на вплив низьких доз іонізуючого випромінювання, яку визначали за зміною активності лізосомного цистеїнового катепсину L у структурах головного мозку щурів. Показано, що дозова залежність активності катепсину L структур головного...»

«Національний лісотехнічний університет України 3. ФАУНА, ЇЇ МОНІТОРИНГ ТА ОХОРОНА УДК 597.6/9 (477) Ст. наук. співроб. Л.І. Горбань – Природний заповідник Розточчя ФАУНА ЛІСОВИХ ВИДІВ АМФІБІЙ ЗАПОВІДНИКА РОЗТОЧЧЯ На території природного заповідника Розточчя виявлено 11 видів амфібій. Серед них лише шість лісових видів належать до переліку Бернської конвенції. Найбільш тісно своєю біологією з лісовими екосистемами пов'язані: Bufo bufo, Triturus vulgaris, Hyla arborea та два види жаб – Rana...»

«ЗБІРНИК НАУКОВИХ ПРАЦЬ №8/2011 р. УДК631.3:636 (075.8) Прасолов Є.Я. Знова Л.В. (Полтавська державна аграрна академія) ВДОСКОНАЛЕННЯ УСТАТКУВАННЯ ПО ВИРОБНИЦТВУ БІОГАЗУ ТА БІОДОБРИВ У статье проведено анализ перспектив внедрение альтернативных источников энергии в АПК. Разработана биогазавая установка которая имеет аератор-обеззараживач, что позволяет получить экологически чистый биогаз и биоудобрения. Ключевые слова: биогаз, аератор-обеззараживач, реактор, охрана окружающей среды. At clause...»

«НАУКОВИЙ ВІСНИК МЕЛІТОПОЛЬСЬКОГО ДЕРЖАВНОГО ПЕДАГОГІЧНОГО УНІВЕРСИТЕТУ УДК 378.6:371.32(54+57) Савчук П.Н. ОРГАНІЗАЦІЯ НАВЧАННЯ ЗАГАЛЬНООСВІТНІХ ДИСЦИПЛІН ХІМІЇ І БІОЛОГІЇ В ПЕДАГОГІЧНОМУ КОЛЕДЖІ Постановка проблеми. В умовах сьогодення, як зазначається у Національній доктрині розвитку освіти України в ХХI столітті [2], виникла потреба в підготовці освічених, моральних, мобільних, конструктивних і практичних людей, здатних до співпраці. Виконання цього відповідального завдання підвищує...»

«МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ ЗАТВЕРДЖУЮ Ректор С.В. Іванов (Підпис) «_» 2013 р ЗАГАЛЬНА БІОТЕХНОЛОГІЯ МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ до практичних занять для студентів напряму підготовки 6.051401 «Біотехнологія» денної форми навчання Всі цитати, цифровий та фактичний СХВАЛЕНО матеріал, бібліографічні відомості на засіданні кафедри перевірені. Написання одиниць біотехнології і мікробіології відповідає стандартам Протокол № 3 від 19.09.2013 р. Підпис...»

«ЛІСІВНИЦТВО І АГРОЛІСОМЕЛІОРАЦІЯ Харків: УкрНДІЛГА, 2009. – Вип. 115 УДК 630*575.17:582.475 В. В. МИТРОЧЕНКО * РЕГІОНАЛЬНИЙ ПРИНЦИП ВИКОРИСТАННЯ ГЕНЕТИЧНО ПОКРАЩЕНОГО НАСІННЯ СОСНИ ЗВИЧАЙНОЇ ДП Київська лісова науково-дослідна станція УкрНДІЛГА Визначено структуру синтетичних популяцій плюсових дерев сосни звичайної восьми областей і природного насадження Київської області за формами череззерності шишок. Виявлені відмінності за структурою природного насадження та синтетичної популяції однієї...»




Продажа зелёных и сухих саженцев столовых сортов Винограда (по Украине)
Тел.: (050)697-98-00, (067)176-69-25, (063)846-28-10
Розовые сорта
Белые сорта
Чёрные сорта
Вегетирующие зелёные саженцы


 
2013 www.uk.x-pdf.ru - «Безкоштовна електронна бібліотека»