«НАЦІОНАЛЬНИЙ СТАНДАРТ УКРАЇНИ _ ЯЙЦЯ ХАРЧОВІ, ПРОДУКТИ ЯЄЧНІ Методи визначання мікробіологічних показників ДСТУ Видання офіційне Київ ДЕРЖСПОЖИВСТАНДАРТ УКРАЇНИ ДСТУ ПЕРЕДМОВА 1. ...»
- якщо кількість колоній більше ніж 100 і остання цифра 5, одержане число округлюють до найближчого числа, кратного 20;
- якщо число більше ніж 100 і його остання цифра не 5, його округлюють до найближчого числа, кратного 10.
Кількість мікроорганізмів КУО в 1 г або у 1 см3 яєчних продуктів обчислюють за формулою:
а ·10 n Х = _____________, (1) V де Х – кількість мікроорганізмів КУО;
а – округлене середнє арифметичне число колоній на чашках;
V - об’єм посівного матеріалу, внесеного у чашку, см3;
n – ступінь десятикратного розведення продукту.
ДСТУ Результати досліджувань записують таким чином: кількість мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів 1,0 х 10 КУО/г (см3) і т.д. до 9,9 х 10 КОЕ/г (см3) продукту.
5.2 ВИЗНАЧАННЯ БАКТЕРІЙ ГРУПИ КИШКОВИХ ПАЛИЧОК
Метод засновано на здатності бактерій групи кишкових паличок ферментувати лактозу з утворенням кислоти і газу.5.2.1 Засоби та допоміжні пристрої:
- середовище Кесслера з лактозою згідно з А.7 Додатку А цього стандарту;
- середовище Хейфеца згідно з А.8 Додатку А цього стандарту;
- середовище Ендо згідно з А.21 Додатку А цього стандарту;
-термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з до 55 оС з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
- мікроскоп марки “Биолам Д-11” або аналогічний згідно з ГОСТ 8074;
- пробірки скляні згідно з ГОСТ 25336.
5.2.2 Методика та правила проведення досліджування По 1 см3 із розведень сухих або рідких яєчних продуктів, приготованих згідно з 4.4, вносять у пробірки із середовищем Кесслера або Хейфеца. Посіви (37±1) оС протягом (24±1) год. Із пробірок з інкубують за температури ознаками росту бактерій (зміна кольору середовища, помутніння, газоутворення) проводять посів на середовище Ендо. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±1) оС протягом (24±1) год. Потім посіви переглядають і відзначають ріст колоній, характерних для бактерій групи кишкових паличок (пласкі або ледь випуклі чи з обідком, червоні з різноманітною інтенсивністю забарвлення, рожеві, блідо-рожеві з металевим блиском або без нього). Препарати готують не менше ніж з трьох характерних колоній, забарвлюють за Грамом згідно з Додатком Б цього стандарту і мікроскопують.
5.2.3 Опрацювання результатів Результати оцінюють по кожній пробі окремо.
ДСТУ Виявлення на середовищі Ендо характерного зростання колоній, наявність у мазках з цих колоній грамнегативних паличок, що зброджують лактозу з утворенням кислоти і газу за температури (37±1) оС, вказують на виявлення у продукті бактерій групи кишкових паличок.
Результат записують як «не виявлено» або «виявлено» бактерії групи кишкових паличок у 0,1 см3 рідких або 0,1 г сухих яєчних продуктів.
5.3 ВИЯВЛЯННЯ БАКТЕРІЙ РОДУ SALMONELLAE
Метод засновано на використанні середовищ збагачення з подальшим виділенням сальмонел на диференціально-діагностичних середовищах, а також на вивченні культурально-морфологічних, біохімічних і серологічних якостей культур.5.3.1 Засоби та допоміжні пристрої
- середовище Кауфмана згідно з А.12 або середовище магнієве згідно з А.18, або середовище селенітове згідно з А.17 Додатку А цього стандарту;
- вісмут-сульфітний агар, або середовища Плоскірєва, Левіна, Ендо згідно з А.21 Додатку А цього стандарту;
- м’ясо-пептонний агар згідно з А.4, м'ясо-пептонний бульйон згідно з А.3 або пептонна вода згідно з А.5 Додатку А цього стандарту;
- середовище Расселя згідно з А.11, або середовище КрумвідеОлькеницького згідно з А.20, або середовище Кліглера згідно з А.22 Додатку А цього стандарту;
- середовище Гісса з вуглеводами згідно з А.9 Додатку А цього стандарту;
- вуглеводи (малий строкатий ряд): глюкоза, сахароза, мальтоза, фруктоза, лактоза згідно з чинними нормативними документами;
- фізіологічний розчин згідно з чинними нормативними документами;
- щавлева кислота згідно з ГОСТ 22180;
- реактив Ерліха згідно з А.25 Додатку А цього стандарту;
- етиловий ефір згідно з ГОСТ 22300;
- полівалентна адсорбована сальмонельозна сироватка з чинними нормативними документами;
ДСТУ
- ізотонічний розчин хлористого натрію згідно з А.6 Додатку А цього стандарту;
- піпетки пастерівські згідно з чинними нормативними документами;
- колби місткістю 250 см3 згідно з ГОСТ 1770;
- чашки Петрі згідно з ГОСТ 25336;
- петля бактеріологічна згідно з чинними нормативними документами;
- фільтрувальний папір згідно з чинними нормативними документами згідно з ГОСТ 12206;
- предметне скло згідно з ГОСТ 9284;
(2-10)х згідно
-лупа зі збільшенням з чинними нормативними документами;
- термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з до 55 оС з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами.
5.3.2 Методика та правила проведення досліджування 5.3.2.1 25 г сухих чи 25 см3 рідких яєчних продуктів із середньої проби з дотримуванням стерильності вносять у колбу, що містить 225 см3 одного з середовищ (Кауфмана, магнієвого чи селенітового), струшують і інкубують у термостаті за температури (37±1) оС протягом часу від 16 год до 20 год. Потім проводять посів бактеріологічною петлею (діаметром від 0,4 мм до 0,5 мм) із середовищ збагачення у чашки Петрі з вісмут-сульфітним агаром або середовищем Плоскірєва чи Левіна, розтираючи шпателем. Чашки з посівом інкубують у термостаті за температури (37±1) оС. Облік результатів проводять на вісмут-сульфітному агарі через 48 год, на агарі Плоскірєва і Левіна через (18-24) год. На вісмут-сульфітному агарі сальмонели утворюють чорні колонії з характерним металевим блиском, при цьому спостерігають забарвлювання ділянки середовища під колонією у чорний колір і ніжні світло-зелені колонії.
На агарах Плоскірєва і Ендо колонії сальмонел прозорі, на агарі Левіна – голубуваті. За відсутності типових або підозрілих колоній чи за наявності слабкого росту мікробів на щільних диференціальних середовищах чашки з посівами повторно інкубують за температури (37±1) оС протягом (20-24) год.
Потім знову визначають наявність колоній сальмонел. У разі виявлення ДСТУ підозрілих колоній продовжують досліджування. У протилежному випадку роботу з посівами припиняють.
5.3.2.2 За наявності підозрілих типових, характерних для сальмонел колоній, з них відбирають не менше трьох колоній. Якщо на одній чашці спостерігають менше ніж 3 типові колонії, то відбирають усі підозрілі колонії, що виросли, для пересівання у пробірки: зі скошеним поживним або м'ясопептонним агаром, з м'ясо-пептонним бульйоном, з пептонною водою і на одне із диференційованих середовищ Расселя, Крумвіде-Олькеницького, Кліглера.
Середовища Расселя, Крумвіде-Олькеницького, Кліглера засівають спочатку штрихом на скошену поверхню, а потім уколюванням у глибину стовпчика. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±1) оС протягом (24±1) год.
Культури, що виросли на поверхні скошеного агару, використовують для постановки реакції аглютинації і виготовлення мазків. Мазки зафарбовують за Грамом згідно з Додатком Б і мікроскопують. Сальмонели – грамнегативні палички. Посіви на м'ясо-пептонному бульйоні і пептонній воді використовують для визначення здатності виділених культур утворювати сірководень та індол.
Ріст бактерій на середовищах Раселя, Крумвіде-Олькеницького і Кліглера підтверджує наявність сальмонел у продукті.
На середовищах Раселя, Крумвіде-Олькеницького, Кліглера оцінюють забарвлення і газоутворення. При рості бактерій у середовищах Раселя, Крумвіде-Олькеницького, Кліглера стовпчик забарвлюється у малиновий колір (за рахунок глюкози), скошена частина середовища залишається блідо-рожевою за відсутності розщеплювання лактози та сахарози. Газоутворення встановлюють по тріщинах і розривах стовпчиків агару. На середовищах Крумвіде-Олькеницького і Кліглера утворювання сірководню виявляють на підставі почорніння середовища (від темної лінії по місцю протоколу середовища до розлитого почорніння усього стовпчика). Розщеплення сечовини виявляють за відновленням первісного кольору (блідо-рожевого) стовпчика середовища.
Сальмонели не розкладають сечовину, а утворюють сірководень.
ДСТУ 5.3.
2.3 У разі необхідності визначання більш повної біохімічної характеристики культури пересівають на кольорові середовища Гісса з вуглеводами («короткий строкатий ряд» з глюкозою, лактозою, сахарозою, маннітом і мальтозою) і визначають їхню здатність утворювати індол та сірководень.
З цією метою добову культуру, відібрану зі скошеного поживного або м'ясо-пептонного агару, розтирають в 1,0 см3 фізіологічного розчину. Потім по 2 краплі (0,2 см3) суміші вносять пастерівською піпеткою у середовище Гісса, пептонну воду або м'ясо-пептонний бульйон. Поживні середовища з посівами інкубують у термостаті за температури (37±1) оС.
Через 24 год на середовищах Гісса визначають кислотоутворення (середовища, набувають рожево-червоного кольору) і газоутворення (наявність бульбочок у поплавках).
Сальмонели не ферментують лактозу і сахарозу, ферментують глюкозу з утворенням кислоти і газу.
Для виявлення індолу у пробірку з м'ясо-пептонним бульйоном або пептонною водою відразу після посіву досліджуваної культури поміщають смужку фільтрувального паперу, змочену насиченим водним розчином щавлевої кислоти. Смужку поміщають таким чином, щоб вона утримувалася корком, але не торкалася до середовища. За наявності індолу через (1-3) дні інкубування у термостаті за температури (37±1) оС нижня частина смужки зафарбовується у рожевий колір, помітний у прохідному світлі.
Індол можна визначити і іншим способом: у пробірку з добовою бульйонною культурою обережно по стінці додають від п’яти до десяти крапель реактиву Еріха. Перед додаванням реактиву до бульйону можна ввести 2 см3 етилового ефіру. За наявності індолу не пізніше ніж через 5 хв. у прикордонному шарі утворюється яскраво-червоне кільце. Сальмонели індолу не утворюють.
5.3.2.4 Належність виділених культур до роду сальмонел визначається реакцією аглютинації на склі з полівалентною адсорбованою сальмонельозною сироваткою.
На предметне скло поміщають краплю ізотонічного розчину хлористого ДСТУ натрію і поряд краплю полівалентної аглютинуючої сальмонельозної сироватки. Потім у кожну з приготованих крапель, починаючи з ізотонічного розчину, вносять петлею частину аналізованої колонії, рівномірно розтирають і гойдають предметним склом протягом часу від 30 с до 60 с. Кладуть скло на темний фон і розглядають за допомогою збільшувального скла (лупи). У випадку позитивної реакції аглютинації через (0,5-2,0) хв у краплі сироватки утворюються пластівці, рідина висвітлюється.
У краплі з ізотонічним розчином залишається рівномірне помутніння.
5.3.3 Опрацювання результатів Результати оцінюють за кожною пробою окремо.
Штами, що дають типові біохімічні зміни і позитивні серологічні реакції з полівалентною аглютинуючою сальмонельозною сироваткою, відносять до сальмонел.
5.4 МЕТОД ВИЗНАЧАННЯ БАКТЕРІЙ РОДУ PROTEUS
Метод засновано на висіванні певної кількості продукту у конденсаційну воду свіжоскошеного агару, здатності бактерій роду Рroteus надавати повзучий ріст, випереджаючий інші види бактерій, і утворювати сірководень.5.4.1 Засоби та допоміжні пристрої
- м'ясо-пептонний агар згідно з А.4 Додатку А цього стандарту;
- середовище Крумвіде-Олькеницького згідно з А.20, або середовище Кліглера згідно з А.22 Додатку А цього стандарту;
- пробірки скляні згідно з ГОСТ 25336;
-термостат електричний для вирощування мікроорганізмів з до 55 оС з автоматичним терморегулятором, що забезпечує температуру точністю ±0,2 оС, згідно з чинними нормативними документами;
- мікроскоп марки “Биолам Д-11” або аналогічний згідно з ГОСТ 8074.
5.4.2 Методика та правила проведення досліджування 1 см3 рідких яєчних продуктів або 1 см3 з розведення 1:10, приготованих згідно з 4.4.2 сухих яєчних продуктів, вносять у конденсаційну воду пробірок зі свіжоскошеним поживним або м'ясо-пептонним агаром, не торкаючись до скошеної поверхні середовища. Посіви інкубують у термостаті за температури (37±1) оС протягом 24 год.
ДСТУ При обліку посівів звертають увагу на утворення на скошеному агарі повзучого муароподібного нальоту з блакитнуватим відтінком, який піднімається з конденсаційної рідини до верху по поверхні середовища і випускає різкий гнилісний запах. У разі появи характерного росту мікробів роду Рroteus готують мазки, зафарбовують їх за Грамом згідно з Додатком Б, мікроскопують. Бактерії роду Рroteus – грамнегативні палички, які не утворюють спори.
Для визначання здатності утворювати сірководень підозрілі культури з агару висівають методом уколювання у стовпчик і штрихами по скошеній поверхні одного із середовищ: Крумвіде-Олькеницького чи Клігера. Посіви витримують у термостаті за температури (37±1) оС протягом (24±1) год. Якщо утворюється сірководень, стовпчик середовища чорніє. Бактерії роду Рroteus утворюють сірководень, при цьому у стовпчику з’являється газ, що вказує на ферментацію глюкози.
5.4.3 Опрацювання результатів Результати оцінюють за кожною пробою окремо.
Наявність характерного росту у вигляді тонкого муароподібного нальоту, що піднімається доверху від конденсату на свіжоскошеному агарі, різкого гнилісного запаху, не утворюючих спор грамнегативних паличок, в мазках, що утворюють сірководень, вказують на присутність бактерій роду Рroteus в 1 см3 рідких і в 0,1 г сухих яєчних продуктів.
5.5 МЕТОД ВИЯВЛЯННЯ БАКТЕРІЙ РОДУ STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
Метод засновано на висіванні певної кількості продукту або його розведень у селективні поживні середовища, здатності стафілококів зростати на середовищах з підвищеним вмістом хлористого натрію, коагулювати плазму кролика і утворювати кислоту із манніту і мальтози в аеробних умовах.5.5.1 Засоби та допоміжні пристрої
- сольовий бульйон згідно з А.23 Додатку А цього стандарту;
- жовтково-сольовий агар згідно з А.24 Додатку А цього стандарту;
- м'ясо-пептонний агар згідно з А.4 Додатку А цього стандарту;
ДСТУ
- агар сухий поживний згідно з чинними нормативними документами або агар мікробіологічний згідно з ГОСТ 17206;
«